Anonymous User
Login / Registration

Gastroenterologie
a hepatologie

Gastroenterology and Hepatology

Čes a Slov Gastroent a Hepatol 2009; 63(5): 208-215.

The NOD2/CARD15 gene polymorphimsms are significantly associated with the early- onset Crohn’s disesase in Slovak patients population

Marián Bátovský, Barbora Desatová, Tatiana Novotná, Peter Celec, Gabriel Minárik, Denisa Baláková, Tomáš Szemes, Ladislava Bartošová, Igor Páv, Zuzana Zelinková

Summary

SUMMARY

Bátovský M, Desatová B, Páv I, Novotná T, Celec P, Minárik G, Baláková D, Szemes T, Bartošová L, Zelinková Z. The NOD2/CARD15 gene polymorphimsms are significantly associated with the early- onset Crohn’s disesase in Slovak patients population

Introduction: Influence of genetic factors in the aethiology of inflammatory bowel disease (IBD) is more important in Crohn’s disease (CD) than in ulcerative colitis (UC). Clinical gastroenterologists have focused on the consequences of being a NOD2/CARD15 gene polymorphism carrier with respect to onset, localisation and behaviour of CD.

The aims of the study: 1. To investigate the prevalence of polymorphisms in NOD2/CARD15 gene in Slovak patients with CD and with UC in comparison with healthy controls, 2. confirm the link between NOD2/CARD15 gene mutations and a) the supposedly lower age at disease onset, b) localisation in terminal ileum, c) the predominatly stricturizing form of CD.

Set of patients and methods: In total 93 IBD patients (52 CD and 41 UC) and 22 controls without IBD were genotyped. The single nucleotide polymorphisms (SNP) NOD2/CARD15 gene associated with CD (R702W, G908R and 1007fs) were assessed using the restriction fragments lenght polymorphisms polymerase chain reaction in IBD patients and in healthy controls. The allele frequency of these polymorphisms was determined and genotype-phenotype correlation was specified. The difference in allele frequencies between IBD patients and the controls as well as differences between phenotypes were analysed statistically using ANOVA test.

Results: The allele frequencies of studied NOD2/ CARD15 SNP were significantly higher in CD (30/52) compared with UC patients (8/41, p = 0.007) and with healthy controls (3/22, p = 0.003). This applied for the frequency of 1007fs polymorphism in particular (p = 0.004 and p = 0.023 respectively for UC and healthy controls), especially for homozygotes (p = 0.072, p = 0.014). In the analysis of genotype-phenotype correlations, NOD2/CARD15 gene polymorphisms were significantly associated with early-onset CD (under 16 years, p = 0.001). The association with terminal ileum localisation and stricturizing form of disease was not found (p = 0.1989 and 0.270 irresp.).

Conclusion: In the present study, we confirmed the association of NOD2/CARD15 variants with CD in a population not studied so far. In addition, this association is characterized by a gene dose effect and the studied NOD2/CARD15 variants are related to early-onset disease.

Key words: NOD2/CARD15 gene - gene polymorphism - Crohn’s disease - ulcerative colitis.

Génový polymorfizmus NOD2/CARD15 významne vplýva na skorší vznik Crohnovej choroby v populácii slovenských pacientov The NOD2/CARD15 gene polymorphimsms are significantly associated with the early- onset Crohn’s disesase in Slovak patients population Marian Bátovský1, Barbora Desatová1, Igor Páv1, Táňa Novotná1, Peter Celec2, Gabriel Minárik2, Denisa Baláková3, Tomáš Szemes3, Ladislava Bartošová4, Zuzana Zelinková5 1Gastroenterologická klinika SZU a FNsP, Bratislava
2 Ústav molekulárnej biomedicíny LF UK, Bratislava
3Katedra molekulárnej biológie Prírodovedeckej fakulty, Bratislava
4 Ústav humánnej farmakológie a toxikológie Farmaceutickej fakulty Veterinárnej a farmaceutickej univerzity Brno
5Erasmus Medical Center, Rotterdam

SÚHRN

Bátovský M, Desatová B, Páv I, Novotná T, Celec P, Minárik G, Baláková D, Szemes T, Bartošová L, Zelinková Z. Génový polymorfizmus NOD2/CARD15 významne vplýva na skorší vznik Crohnovej choroby v populácii slovenských pacientov

Úvod: Vplyv genetických faktorov na etiológiu nešpecifických črevných zápalov (IBD) je významnejší pri Crohnovej chorobe (CD) ako pri ulceróznej kolitíde (UC). Klinickí gastroenterológovia sa zamerali najmä na nosičstvo polymorfizmu génu NOD2/CARD15 a jeho fenotypovú manifestáciu vzhµadom na vek vzniku ochorenia, jeho lokalizáciu a priebeh.

Ciele práce: 1. Zisti» prevalenciu polymorfizmov génu NOD2/CARD15 v súbore pacientov s CD a s UC v porovnaní s kontrolnou skupinou, 2. Potvrdi» vz»ah medzi nosičstvom génového polymorfizmu NOD2/CARD15 a a) predpokladaným vznikom ochorenia v nižšom veku, b) so suponovanou častejšou lokalizáciou v terminálnom ileu ako aj c) s predominantne strikturizujúcou formou ochorenia.

Materiál a metódy: Vyšetrovaný súbor tvorilo 52 pacientov s CD, 41 pacientov s UC a 22 kontrolných jedincov bez IBD. Jednotlivé nukleotidové polymorfizmy génu NOD2/CARD15 spojené s CD (R703W, G9O8R a 1007fs) boli zis»ované metódou polymerázovej re»azovej reakcie s následným štiepením špecifickými reštrikčnými endonukleázami. Po stanovení alelovej frekvencie týchto polymorfizmov bola špecifikovaná genotypovo-fenotypová korelácia. Rozdiely vo výskyte alelových frekvencií medzi IBD pacientmi a kontrolami ako aj fenotypové rozdiely boli štatisticky analyzované pomocou ANOVA testu.

Výsledky: Alelová frekvencia sledovaných génových polymorfizmov NOD2/CARD15 bola signifikantne vyššia v súbore CD pacientov (30/52) než u UC pacientov (8/41, p = 0,007) ako aj v porovnaní s kontrolnou skupinou (3/22, p = 0,003), čo platilo najmä pre polymorfizmus génu 1007fs (p = 0,004, resp. p = 0,023) a pre homozygótov (p = 0,072, p = 0,014). Analýza genotypovo-fenotypových korelácii dokázala, že polymorfizmus génu NOD2/ CARD15 bol štatisticky významne spojený s nižším vekom pri vzniku CD (do 16 rokov, p = 0,001), Asociácie s lokalizáciou v terminálnom ileu a so strikturizujúcou formou CD neboli potvrdené (p = 0,189 a p = 0,270).

Záver: V predkladanej štúdii sme potvrdili na Slovensku doteraz nezis»ovanú asociáciu variant génu NOD2/CARD15 s CD, ktorá sa fenotypovo manifestuje nižším vekom pri vzniku tohto ochorenia.

Kµúčové slová: gén NOD2/CARD15 - génový polymorfizmus - Crohnova choroba - ulcerózna kolitída.

SUMMARY

Bátovský M, Desatová B, Páv I, Novotná T, Celec P, Minárik G, Baláková D, Szemes T, Bartošová L, Zelinková Z. The NOD2/CARD15 gene polymorphimsms are significantly associated with the early- onset Crohn’s disesase in Slovak patients population

Introduction: Influence of genetic factors in the aethiology of inflammatory bowel disease (IBD) is more important in Crohn’s disease (CD) than in ulcerative colitis (UC). Clinical gastroenterologists have focused on the consequences of being a NOD2/CARD15 gene polymorphism carrier with respect to onset, localisation and behaviour of CD.

The aims of the study: 1. To investigate the prevalence of polymorphisms in NOD2/CARD15 gene in Slovak patients with CD and with UC in comparison with healthy controls, 2. confirm the link between NOD2/CARD15 gene mutations and a) the supposedly lower age at disease onset, b) localisation in terminal ileum, c) the predominatly stricturizing form of CD.

Set of patients and methods: In total 93 IBD patients (52 CD and 41 UC) and 22 controls without IBD were genotyped. The single nucleotide polymorphisms (SNP) NOD2/CARD15 gene associated with CD (R702W, G908R and 1007fs) were assessed using the restriction fragments lenght polymorphisms polymerase chain reaction in IBD patients and in healthy controls. The allele frequency of these polymorphisms was determined and genotype-phenotype correlation was specified. The difference in allele frequencies between IBD patients and the controls as well as differences between phenotypes were analysed statistically using ANOVA test.

Results: The allele frequencies of studied NOD2/ CARD15 SNP were significantly higher in CD (30/52) compared with UC patients (8/41, p = 0.007) and with healthy controls (3/22, p = 0.003). This applied for the frequency of 1007fs polymorphism in particular (p = 0.004 and p = 0.023 respectively for UC and healthy controls), especially for homozygotes (p = 0.072, p = 0.014). In the analysis of genotype-phenotype correlations, NOD2/CARD15 gene polymorphisms were significantly associated with early-onset CD (under 16 years, p = 0.001). The association with terminal ileum localisation and stricturizing form of disease was not found (p = 0.1989 and 0.270 irresp.).

Conclusion: In the present study, we confirmed the association of NOD2/CARD15 variants with CD in a population not studied so far. In addition, this association is characterized by a gene dose effect and the studied NOD2/CARD15 variants are related to early-onset disease.

Key words: NOD2/CARD15 gene - gene polymorphism - Crohn’s disease - ulcerative colitis.

ÚVOD

Od Ríma po Montreal

Medzinárodná pracovná skupina, ktorá vydala prvú známejšiu klasifikáciu Crohnovej choroby (CD), zasadala roku 1991 v Ríme a opierala sa o anatomické rozdelenie, anamnézu chirurgického zákroku ako aj o klinické správanie sa ochorenia. V tomto zmysle postulovala tri základné formy CD: zápalovú, fistulujúcu a stenotizujúcu. Počas Svetového gastroenterologického kongresu, ktorý sa konal vo Viedni roku 1998, vznikla subtílnejšie diferencovaná klasifikácia, ktorá sa snažila prihliada» na odlišnú patofyziológiu rozličných fenotypických manifestácii CD. Viedenská klasifikácia CD klasifikovala kategóriu A (age) veku vzniku ochorenia na dve skupiny: A1 do 40 rokov a A2 nad 40 rokov. Kategória L (location) obsahovala štyri skupiny postihnutia jednotlivých etáží tráviacej trubice: L1 - terminálne ileum, L2 - hrubé črevo, L3 - ileokolon a L4 - horný úsek tráviaceho traktu. Kategória B (behavior) rozdelila CD pacientov podµa vývoja a formy ochorenia do troch skupín: B1 - nestrikturizujúca-nepenetrujúca forma, B2 - strikturizujúca forma s tvorbou stenóz a B3 - penetrujúca forma so vznikom fistúl.

CSGH 5/2009

Roku 2005 bola pri príležitosti ďalšieho Svetového gastroenterologického kongresu v Montreali prezentovaná najnovšia klasifikácia CD, ktorá priniesla tri na prvý pohµad nenápadné ale v skutočnosti významné zmeny (tab.1).

1. Montrealská klasifikácia CD sa v porovnaní s Viedenskou zmenila v zavedení novej vekovej kategórie A1 do 16 rokov veku vzniku ochorenia, čo sa odrazilo v posunutí veku vzniku CD medzi 17-40 rokov do skupiny A2 a veku nad 40 rokov do skupiny A3. Tieto zmeny odrážali výsledky viacerých štúdii demonštrujúcich prítomnos» špecifických sérotypov, ale najmä genotypov práve vtedy, keď sa vznik choroby zachytil už v detskom veku.

2. Ďalšia klasifikačná úprava sa týkala kategórie L4 v zmysle jej premenovania na "izolované postihnutie horného úseku tráviaceho traktu". Viedenská klasifikácia totiž neposkytovala priestor na samostatné klasifikovanie dovtedy zriedkavej formy CD s postihnutím horného úseku zažívacieho traktu. Predovšetkým rozvoj kapsulovej endoskopie však ukázal, že samostatné postihnutie tejto časti nie je až také raritné a môže sa združova» aj s inou, distálnejšou lokalizáciou ochorenia.

3. Poslednú klasifikačnú zmenu prinieslo zaradenie modifikátora "p", čo značí perianálne postihnutie. Písmeno "p" sa pridáva k označeniam B1-3, ak je súčasne prítomné perianálne ochorenie. Perianálne fistuly nie sú totiž vždy zhodné s intestinálnou penetrujúcou formou ochorenia (B3), aj keď sa s ňou môžu často združova». Pokiaµ sa však vyskytujú pri forme B1 alebo B2, odlišujú sa od B3 prognózou i liečbou(1).

Polymorfizmus génu NOD2/CARD15 a jeho fenotypická manifestácia pri CD

CSGH 5/2009

Viaceré práce z oblasti molekulárnej biológie podporujú teóriu vzniku CD v dôsledku dysregulácie normálnej imunitnej odpovede na prítomnos» komenzálnych baktérii v čreve geneticky disponovaných jedincov. Intraluminálne baktérie sa nachádzajú v najvyšších koncentráciach práve v ileokolone, ktoré je najčastejším miestom postihnutia tráviacej trubice. Na začiatku vzniku tejto koncepcie stáli myšie modely CD, v ktorých sa priebeh choroby zlepšil v prostredí sterilného čreva(2). Na účas» genetických mechanizmov zasa upozornila vyššia konkordancia CD ako ulceróznej kolitídy (UC) u monozygótnych dvojčiat(3) a rodinný výskyt nešpecifických črevných zápalov (IBD) u 5-20 % pacientov s týmito chorobami(4).

Nízka incidencia IBD v Ázii a v Afrike v porovnaní so Severnou Amerikou a s Európou je odrazom súčasného pôsobenia genetických i environmentálnych faktorov. Tzv. hygienická hypotéza upozorňuje na vyšší výskyt rôznych autoimunitných a zápalových ochorení v prostredí, kde chýba včasný kontakt s mikrobiálnymi agensami v dôsledku sanitárnych opatrení vyššej úrovne. Vz»ah medzi stravovacími návykmi a črevným mikrobiálnym osídlením síce nebol doteraz dokázaný, avšak už len čisto empiricky mu nemožno uprie» určitý význam. Jediným potvrdeným vonkajším faktorom vzniku CD je fajčenie, ktoré dvojnásobne zvyšuje riziko vzniku tohto ochorenia (spomína sa aj apendektómia a nesteroidné antireumatiká). Iste nie je bez zaujímavosti, že ex-fajčenie na druhej strane rovnakou mierou zvyšuje riziko vzniku UC(5) ako aj údaj francúzskych autorov o nedostatku slnečného žiarenia ako rizikového faktora CD(6).

Epidemiologické štúdie ďalej ukazujú, že až 80 % rodín postihnutých niektorou formou IBD opakuje túto formu (buď CD, alebo UC) u všetkých svojich príslušníkov. Zvyšných 20 % je zmiešaných - niektorí členovia rodiny majú CD a iní UC. Tieto nálezy signalizujú prítomnos» génov, ktoré sú spojené s oboma chorobami a ďalších génov, ktoré sa spájajú výlučne len s CD alebo len s UC (tab. 2)(7).

Jedným z takýchto génov je aj gén NOD2/CARD15, u ktorého sa dokázala významná asociácia s CD. Vyskytuje sa v epitelových bunkách tenkého i hrubého čreva, v monocytoch, v makrofágoch, v T- a B-lymfocytoch ako aj v Panethových a v dendritických bunkách. NOD2/CARD15 je špecifický receptor, určený na rozoznávanie muramyldipeptidu, ktorý je súčas»ou črevných bakteriálnych peptidoglukánov. Väzba NOD2/CARD15 na muramyldipeptid aktivuje sekréciu antibakteriálnych substancií, akými sú alfa-defenzíny, a tiež aktivuje nukleový faktor kappa B (NF-κB), ktorý spúš»a prozápalovú imunitnú odpoveď. Patogenetický mechanizmus, ktorým polymorfizmy génu NOD2/ CARD15 prispievajú k vzniku CD, nie je doteraz jednoznačne definovaný. In vitro vedie polymorfizmus NOD2/CARD15 k vytvoreniu defektného NOD2 proteínu, ktorý zodpovedá za nedostatočnú aktiváciu NF-κB, a tým aj za zníženú produkciu jednak prozápalových proteínov IL-8 a TNF-alfa ako aj protizápalových cytokínov, osobitne IL10(8-10). Práve porušenie tejto regulácie zápalovej odpovede nedostatočnou produkciou IL-10 by mohlo vies» k pretrvávajúcemu slizničnému zápalu u nosičov génového polymorfizmu NOD2/CARD15.

Odkrytie vz»ahu medzi polymorfizmami génu NOD2/CARD15 a Crohnovou chorobou bolo základom hypotézy vzniku CD ako geneticky podmienenej poruchy imunologickej odpovede na črevné baktérie. V jednotlivých krajinách sa postupne potvrdzoval výskyt týchto polymorfizmov až vznikla akási celosvetová mapa(11,12), pričom sa stanovovali najmä tri najčastejšie polymorfizmy génu NOD2/CARD15, a to R702W, G908R a 1007fs. Slovensko na tejto mape doteraz chýbalo, s výnimkou krátkeho klinického zamyslenia nad malou skupinou IBD pacientov(13), resp. ako súčas» česko-slovenského súboru geneticky vyšetrených CD pacientov(14).

Už v dávnejších prácach sa uvádzalo, že polymorfizmy génu NOD2/CARD15 sa fenotypicky manifestujú lokalizáciou ochorenia v terminálnom ileu ako aj včasným vznikom ochorenia v mladšom veku(15). Štúdia nórskej a nemeckej populačnej vzorky tieto skutočnosti potvrdila, zatiaµ čo v v britskej a v španielskej štúdii sa toto tvrdenie nedokázalo(16), rovnako ako predominantné zastúpenie strikturizujúcej formy CD. Taktiež sa objavujú správy o agesívnejšom priebehu CD u nosičov týchto polymorfizmov(17). Okrem zmapovania výskytu polymorfizmov génu NOD2/CARD15 v slovenskej populácii CD pacientov sme sa v tejto práci tiež sústredili na ich fenotypické prejavy.

CIELE PRÁCE

Zisti» frekvenciu polymorfizmov génu NOD2/CARD15, ktorý pozostáva z troch génov - R702W, G908R a 1007fs - v súbore pacientov s CD a porovna» ich výskyt so skupinou UC pacientov ako aj s kontrolnou skupinou jedincov bez IBD.

Urči» štatistickú významnos» vz»ahu medzi nosičstvom génového polymorfizmu NOD2/CARD15 a

  • a) vekom vzniku CD,
  • b) lokalizáciou ochorenia v terminálnom ileu ako aj
  • c) strikturizujúcou formou CD.
SÚBOR PACIENTOV A METÓDA

Vyšetrili sme spolu 115 jedincov - 52 CD pacientov, 41 UC pacientov s histologicky potvrdenou diagnózou IBD a 22 kontrol s negatívnou osobnou a rodinnou anamnézou IBD. V skupine 93 IBD pacientov (priemerný vek 38 rokov, vekové rozpätie 20-79 rokov) bolo 48 mužov (priemerný vek 36 rokov, vekové rozpätie 21-73 rokov) a 45 žien (priemerný vek 39 rokov, vekové rozpätie 20-79 rokov), ktorým boli odobrané vzorky krvi do nátriumcitrátových skúmaviek na stanovenie prítomnosti troch polymorfizmov génu NOD2/CARD15 - R702W, G908R a 1007fs. V protokole bol okrem iných údajov zaznamenaný aj vek vzniku IBD a u CD pacientov lokalizácia postihnutia ako aj forma ochorenia podµa Montrealskej klasifikácie. DNA bola izolovaná z periférnej krvi a jej úsek s hµadaným polymorfizmom bol amplifikovaný pomocou polymerázovej re»azovej reakcie s následným štiepením špecifickými reštrikčnými endonukleázami. Štiepne produkty sa rozdelili na agarózovom géli a vizualizovali ethidium bromidom. Asociácia prítomnosti jednoduchého nukleotidového polymorfizmu s CD alebo UC bola štatisticky vyhodnotená ANOVA testom.

VÝSLEDKY
CSGH 5/2009 CSGH 5/2009 CSGH 5/2009

Porovnanie výskytu génových polymorfizmov NOD2/CARD15 v troch vyšetrovaných skupinách

Alelová frekvencia (počet zmutovaných alel: počet všetkých alel) stúpala od 0, 068 v kontrolnom podsúbore, cez 0,109 v podsúbore UC pacientov až po 0,410 v podsúbore CD pacientov.

Výskyt polymorfizmov vo všetkých troch vyšetrovaných skupinách ukazuje tabuµka 3. Ich počet bol jednoznačne najvyšší v skupine CD pacientov(30), kde sa súčasne nachádzalo aj najviac homozygótov(7) a najviac pacientov s polymorfizmami dvoch génov(6). V skupine UC pacientov sa našlo 8 polymorfizmov, žiadny homozygót a jeden pacient s polymorfizmami dvoch génov. V najmenšej kontrolnej skupine boli zistené iba tri génové polymorfizmy bez nálezu homozygóta, resp. pacienta s mutáciami dvoch génov. Štatisticky významné rozdiely boli zaznamenané vo výskyte polymorfizmov génu NOD2/CARD15, ktoré signifikantne prevažovali v skupine CD pacientov v porovnaní s UC pacientmi (p = 0,003) a s kontrolnou skupinou (p = 0,007). Podobne vysokú hladinu štatistickej významnosti rozdielov sme zaznamenali aj prípade výskytu polymorfizmu génu 1007fs (p = 0,023, resp. 0,004). Výskyt homozygótov bol štatisticky významne rozdielny v prípade polymorfizmov génu NOD2/CARD15 u CD pacientov v porovnaní s UC pacientmi (p = 0,014). Ostatné konštatované rozdiely nepresiahli úroveň štatistickej významnosti požadovanú pre biometrickú štatistiku.

Polymorfizmy génu NOD2/CARD15 a ich fenotypická manifestácia v súbore CD pacientov

V tejto časti bol štatisticky vyhodnotený súbor 52 CD pacientov, ktorý sa rozdelil na podsúbor nosičov polymorfizmov génu NOD2/CARD15 (24 pacientov) a podsúbor CD pacientov, ktorí nevykazovali tieto genetické zmeny (28 pacientov).

Vek vzniku CD a polymorfizmus génu NOD2/CARD15 (tab. 4)

Vek vzniku CD do 16 rokov sme zaznamenali u 9/24 nosičov polymorfizmu génu NOD2/CARD15 a iba u 2/28 CD pacientov bez tejto mutácie, čo bol štatisticky najvýraznejší a štatisticky najvýznamnejší rozdiel zo všetkých troch sledovaných vekových skupín (p = 0,001). V súlade s týmto nálezom bolo vo vekovej skupine 17-40 rokov viac pacientov bez genetického polymorfizmu NOD/CARD15 (23/28) než nosičov tohto polymorfizmu (11/24). Vo vyšetrovanom súbore bolo iba málo pacientov(spolu 7), u ktorých CD prepukla vo veku nad 40 rokov.

Štyria z nich boli nosiči polymorfizmu génu NOD2/CARD15 a zvyšní traja nemali zistenú túto genetickú odchýlku. Rozdiel nebol štatisticky významný (p = 0, 234). Keď sme porovnali výskyt polymorfizmu génu NOD2/CARD15 vo vekovej skupine do 40 rokov a nad 40 rokov (Viedenská klasifikácia), štatistický rozdiel nebol významný (20/24, resp. 25/28, p = 0,540).

Vz»ah polymorfizmov génu NOD2/CARD15 k predpokladanej častejšej lokalizácii CD v terminálnom ileu (tab. 5)

Porovnanie lokalizácie ochorenia medzi nosičmi polymorfizmu génu NOD2/CARD15 neukázalo štatisticky významné rozdiely. Najčastejšie bolo postihnuté kolon, kde vyšla štatistická významnos» v prospech pacientov bez polymorfizmu (10 pacientov bez polymorfizmu vs. 2 pacienti s polymorfizmom génu NOD2/CARD15, p = 0,023). Pri porovnaní lokalizácie CD ochorenia nosičov hµadaného polymorfizmu v terminálnom ileu (13 vs. 10 pacientov) s postihnutím ileokolonu (7 v. 5 pacientov) bolo p = 0,921 a s postihnutím proximálneho GIT (2 v. 3 pacienti) bolo p = 0,520. Aj porovnaním výskytu génového polymorfizmu NOD2/CARD15 medzi pacientmi s lokalizáciou CD v terminálnom ileu a všetkými ostatnými lokalizáciami (ileokolon + kolon + proximálny GIT) nebol zistený štatisticky významný rozdiel (p = 0,189).

Polymorfizmus génu NOD2/CARD15 a predpokladaný častejší výskyt strikturizujúcej formy CD (tab. 6)

Štatistickým vyhodnotením rozdielov medzi oboma podskupinami CD pacientov sa nedokázal predpokladaný častejší výskyt strikturizujúcej formy u nosičov genetického polymorfizmu NOD2/CARD15 (iba 3 pacienti v. 6 pacientov bez polymorfizmu) v porovnaní s výskytom nestrikturizujúcej-nepenetrujúcej (18 pacientov v. 15 pacientov bez polymorfizmu), resp. penetrujúcej formy ochorenia (3 pacienti v. 7 pacienti bez polymorfizmu), p = 0,27, resp. 0,884.

Pri štatistickom hodnotení týchto podskupín s nízkymi počtami pacientov možno pripusti» "chybu malých čísel".

DISKUSIA

V našej štúdii predstavujeme po prvý raz genotypizáciu IBD spojeného s polymorfizmami génu NOD2/CARD15 v slovenskej populácii. V nami študovanej populačnej vzorke CD pacientov sme pozorovali vysoký výskyt najčastejších polymorfizmov génu NOD2/CARD15. Tieto výsledky korelujú s pozorovaním typického výskytu týchto polymorfizmov v kaukazskej populácii(18).

Recentná práca českých autorov(19) potvrdzuje geografickú príbuznos» našich krajín v rozložení génových polymorfizmov NOD2/CARD15 so signifikantne vyšším výskytom polymorfizmu génu 1007fs. V súbore 345 pacientov s CD bolo až 46 % pacientov nosičmi polymorfizmu génu NOD2/CARD15 v porovnaní s 21 % jedincov v súbore 501 kontrol. Vek začiatku vzniku ochorenia bol výrazne modifikovaný alelovou pozitivitou génu 1007fs, ktorá sa našla u 42 % detských CD pacientov, zatiaµ čo u dospelých CD pacientov sa nosičstvo tohto polymorfizmu zistilo iba u 25 % vyšetrených.

Podobné výsledky ako v našej skupine sa našli aj v súbore sicílskych pacientov, prezentovanom Rendovou a Cottonem(20), ktorí tiež zistili vysokú frekvenciu génového polymorfizmu 1007fs v porovnaní s ostatnými územiami okolo Stredozemného mora. Takmer pä»krát vyššiu incidenciu tohto konkrétneho génového polymorfizmu zachytili aj v kontrolnej populačnej vzorke µudí bez IBD. Vysoký výskyt CD na Sicílii je podµa týchto autorov determinovaný geneticky, a to práve vďaka rozšírenému génovému polymorfizmu 1007fs v tamojšej populácii. Na základe paralelnej situácie na Slovensku je možné predpoklada», že za vyše trojnásobným nárastom incidencie CD za posledných 8 rokov(13) sa skrýva "premorenos»" našej populácie genetickými polymorfizmami NOD2/CARD15, za ktorými stojí najmä vysoké zastúpenie polymorfizmu génu 1007fs. Za účelom potvrdenia tohto predpokladu je potrebné zhromaždi» väčšie množstvo geneticky vyšetrených CD pacientov a kontrolných skupín.

Dosiaµ zistené genetické polymorfizmy, ktoré významne korelujú s CD, tvoria iba 20 % všetkých zistených genetických variácii, diagnostikovaných pri tomto ochorení. Na potvrdenie skutočného genetického prínosu v diagnostike CD sa teda ešte iba čaká. Zatiaµ sú v tejto oblasti najväčším prínosom a sµubnou perspektívou výsledky štúdii µudského genómu, ktoré v ňom hµadajú jednotlivé gény asociované s CD (tzv. GWA štúdie - genome-wide association studies). Opierajú sa o stanovenie veµkého počtu polymorfizmov (single-nucleotide polymorphisms - SNPs), pričom hµadajú korelácie s najčastejšími humánnymi chorobami, a teda aj s CD. Potrebné údaje čerpajú z HapMap, čo je akási banka genetických variácii človeka, ktoré sa vyskytujú v µudskej DNA. Tento katalóg informuje o rozložení jednotlivých polymorfizmov v rôznych populáciach sveta. GWA genotypizácia zahŕňa státisíce markerov a porovnáva alelovú frekvenciu chorých osôb so zdravými kontrolami(21).

Nedávno publikovaná štúdia holandskej a belgickej populácie naznačuje smer, ktorým sa môže ubera» klinická genetika IBD(22). V danej populácii autori vypracovali model pre genetický rizikový profil CD, ktorý zahŕňa analýzu všetkých doteraz známych polymorfizmov. Základom rizikového profilu je skutočnos», že riziko pre vznik CD rastie so stúpajúcim počtom génových polymorfizmov. CD je teda typickým polygénovým ochorením, pre vznik ktorého je dôležitá akumulácia jednotlivých genetických defektov.

Metanalýza 39 štúdii ukázala, že riziko vzniku CD je pre jednoduchého heterozygóta polymorfizmu génu NOD2/CARD15 2,4 (CI 2,0-2,9) a pre homozygóta alebo kombinovaného heterozygóta (s postihnutím jednej alely na viacerých génoch) dosahuje až 17,1 (CI 10,7-27,2)(23). Napriek tomu, že polymorfizmy génu NOD2/CARD15 sú v mnohých štúdiach potvrdzované ako diagnostické entity štatisticky významne asociované s CD, je zrejmé, že ich genetická penetrancia je limitovaná. Táto skutočnos» svedčí o nedostatočnosti samotných polymorfizmov génu NOD2/CARD15 na vysvetlenie indukcie vzniku ochorenia(11). Aj otázka poklesu expresie alfa-defenzínov, akýchsi telu vlastných "antibiotík" v terminálnom ileu v dôsledku prítomnosti polymorfizmov génu NOD2/CARD15, ktorá bola ešte pred pár rokmi intenzívne pertraktovaná vo vz»ahu k CD, sa postupne dostáva do ústrania. Deje sa tak po zistení, že tento pokles vlastne vzniká ako sekundárny následok samotného črevného zápalového procesu, a nie v dôsledku mutačného statusu génu NOD2/CARD15(24-26).

Hµadanie ďalších genetických spojení s CD vyústilo v novších prácach do poznania, že hlavné genetické asociácie s CD možno rozdeli» na gény zodpovedné za riadenie prirodzenej imunitnej odpovede a na gény prispievajúce k adaptačnej imunitnej odpovedi. V ramene prirodzenej imunitnej odpovede sú zastúpené polymorfizmy génu NOD2/CARD15, ale aj ďalšie tzv. autofágové gény ATG16L1 a IRGM. Možno predpoklada», že primárny defekt v intracelulárnej reakcii na črevné baktérie vyústi v kompenzačný nárast aktivity Th1 buniek, ktoré sa zis»ujú v lamina propria pacientov s CD Hlavným genetickým predstaviteµom adaptačnej imunitnej odpovede je protektívny gén IL23R, ktorého expresia sa významne znižuje pri CD. Heterozygótne nosičstvo jeho polymorfizmu Arg381Gln zvyšuje ochranu pred vznikom CD až trojnásobne. Ďalšie génové polymorfizmy adaptačnej imunitnej odpovede sú IL12B a STAT3, ktoré sa našli aj pri UC. Ako výzva pri objasňovaní vz»ahu CD k ďalším génovým polymorfizmom sú aktuálne gény PTGER4, SLC22A4, SLC22A5, P4HA2, IRF1, ktoré sa v súčasnosti intenzívne skúmajú(7,20).

ZÁVER

1. Vo vyšetrovanom súbore pacientov sa štatisticky potvrdil významne vyšší výskyt polymorfizmu génu NOD2/CARD15 u pacientov s CD v porovnaní s UC pacientmi ako aj v porovnaní s kontrolnou skupinou. Z troch najčastejšie skúmaných polymorfizmov tohto génu - R702W, G908R a 1007fs - sa našlo signifikantne vysoké zastúpenie posledne menovaného polymorfizmu práve v skupine CD pacientov. Aj výskyt homozygótov, ktorí boli nosičmi polymorfizmu génu NOD2/CARD15, bol významne častejší v skupine CD pacientov v porovnaní so skupinou UC pacientov. Tieto nálezy potvrdzujú vz»ah CD ku génovému polymorfizmu NOD2/CARD15.

2. Z troch predpokladaných fenotypových manifestácii nosičstva polymorfizmu génu NOD2/CARD15 - včasný vznik ochorenia v mladom veku, postihnutie terminálneho ilea a strikturizujúca forma CD - sa v predloženom podsúbore CD pacientov dokázal štatisticky vysoko významný vz»ah medzi nosičstvom vyšetrovaného polymorfizmu a včasným vznikom CD do 16 rokov veku života pacienta. Pri ďalších dvoch skúmaných fenotypových parametroch sa tento vz»ah nepotvrdil.

3. Gén NOD2/CARD15 je síce najčastejšie potvrdzovaným, ale iba jedným z kandidátnych génov vz»ahu ku CD. Zastupuje skupinu génov prirodzenej imunity, do ktorej patria aj ďalšie gény (autofágové gény ATG16L1, IRGM), ktorých počet sa neustále upresňuje. Podµa recentných literárnych údajov okrem polymorfizmov génov prirodzenej imunity sa na vzniku a priebehu CD môžu podieµa» aj polymorfizmy adaptačnej imunity (IL23R, IL12B, STAT3). Len systematické skúmanie tejto genetickej mozaiky môže perspektívne vies» ku komplexnému pochopeniu patogenézy CD. Tento prístup plánujeme využi» aj pri ďalšom vyšetrovaní našich CD pacientov.

Experimentálna čas» tejto práce bola finančne podporená grantovým projektom IGA MZ ČR č. NR9342-3/2007 (Brno).

Autori ďakujú firme Schering-Plough-Abbott za zabezpečenie štatistickej analýzy dosiahnutých výsledkov.

Literatúra
  • 1. Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, Colombel J-F. The Montreal classification of inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut 2006; 55: 749-753.
  • 2. Elson CO. Experimental models of inflammatory bowel disease reveal innate, adaptive, and regulatory mechanisms of host dialogue with the microbiota. Immunol Rev 2005; 206: 260-276.
  • 3. Cho JH, Weaver CT. The genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2007; 133: 1327-1339.
  • 4. Binder V. Genetic epidemiology in inflammatory bowel disease. Digest Dis 1998; 16: 351-355.
  • 5. Gent AE, Hellier MD, Grace RH, Swrbrick ET, Coggon D. Inflammatory bowel disease and domestic hygiene in infancy. Lancet 1987; 343: 766-767.
  • 6. Nerich V, Monnet E, Boutron-Ruault M-C, Allemand H, Weill A, Carbonel F. Geographioc distribution od inflammatory bowel disease (IBD) in France and sunlight exposure. Digestive Disease Week 2009, Chicago 30. 5.-4. 6. 2009, A115.
  • 7. Cho JH. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 2008; 8: 458-466.
  • 8. Devlin SM, Yang H, Ippoliti A, Taylor KD, Landers CJ, Su X, Abreeu MT, Papadakis KA, Vasiliauskas EA, Melmed GY, Fleshner PR, Mei L, Rotter JJ, Targan SA. NOD2 variants and antibody response to microbial agents in Crohn’s disease patients and their unafected relatives. Gastroenterology 2007; 132: 576-586.
  • 9. Karban A, Dagan E, Eliakim R. Prevalence and significance of mutationsin the familial Mediteranean fever gene in patients with the Crohn’s disease. Genes Imun 2005; 6: 134-139.
  • 10. Kobayashi KS. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive imunity in the intestinal tract. Science 2005; 307: 731-734.
  • 11. Hugot J-P, Zaccaria I, Cavanaugh J, Yang H, Vermeire S, Lappalainen M, Schreiber S, Annese V, Jewell DP, Fowler EV, Brant SR, Silverberg MS, Cho J, Rioux JD, Satsangi J, Parkes M. Prevalence of CARD15/NOD2 mutations in caucasian healthy people. Am J Gastroenterol 2007; 102: 1259-1267.
  • 12. Pauleau AL, Murray PJ. Role of NOD2 in the response of macrophages to Toll-like receptor agonists. Mol Cell Biol 2003; 23: 7531-7539.
  • 13. Bátovský M, Bartošová L. Klinická gastroenterológia a súčasná genetika Crohnovej choroby: riešime moderný alebo iba módny problém? Folia Gastroenterol Hepatol 2007; 5: 7-12.
  • 14. Hošek J, Bartošová, L, Gregor P, Kolorz M, Dítě P, Bátovský M, Bartoš M. Frequency of representative single nucleotide polymorphisms associated with inflammatory bowel disease in the Czech Republic and Slovak Republic. Folia Biologica (Praha) 2008; 54: 88-96.
  • 15. Podolsky DK. Inflammatory bowel disease. N Engl J Med 2002; 347: 417-422.
  • 16. Mendoza JL, Urcelay E, Lana R. Polymorphisms in interleukin-10 gene according to mutations of NOD2/ CARD15 gene and relation to phenotype in Spanish population with Crohn’s disease. World J Gastroenterol 2006; 12: 443-448.
  • 17. Angelberger S, Reinisch W, Dejaco C, Miehsler W, Waldhoer T, Wehkamp J, Lichtenberger C, Schaeffeler E, Vogelsang H, Schwab M, Teml A. NOD2/CARD15 gene variants are linked to failure of antibiotic tratment in perianal fistulating Crohn disease. Am J Gastroenterol 2008; 103: 1197-1202.
  • 18. Gasche C, Nemeth M, Grundtner P, Willheim- Polli C, Ferenci P, Schwarzenbacher R. Evolution of Crohn’s disease - associated Nod2 mutations. Immunogenetics 2008; 60: 115-120.
  • 19. Hradsky O, Lenicek M, Dusatkova P, Bronsky J, Nevoral J, Valtrova V, Kotalova R, Szitanyi P, Starzykova L, Bortlik M, Vitek L, Lukas M, Cinek O. Variats of CARD15, TNFA and PTPN22 and susceptibility to Crohn’s disease in Czech population: high frequency of the CARD15 1007fs. Tissue antigens 2008; 71: 538-547.
  • 20. Renda MC, Cottone M. Prevalence of CARD15/NOD2 mutations in the Sicilian population. Am J Gastroenterol 2008; 103: 248-249.
  • 21. Rioux JD, Xavier RJ, Taylor KD, Silverberg MS, Goyette P, Huett A, Green T, Kuballa P, Barmada MM, Datta LW, Shugart YY, Griffits AM, Targan SR, Ippoliti AE, Bernard E-J, Mei L, Nicolae DL, Regueiro M, Schumm LP, Steinhart AH, Rotter JI, Duerr RH, Cho JH, Daly MJ, Brant SR. Genome- wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn’s disease and implicates autophagy in disease pathogenetis. Nat Genet 2007; 39: 596-604.
  • 22. Weersma RK, Stokkers PCF, Cleynen I, Wolfkamp SCS, Henckaerts L, Schreiber S, Dijkstra G, Franke A, Nolte IM, Rutgeerts P, Wijmenga C, Vermeire S. Confirmation of multiple Crohn’s disease susceptibility loci in a large Dutch-Belgian cohort. Am J Gastroenterology 2009; 104: 630-638.
  • 23. Economou M, Trikalinos TA, Loizou KT, Tsianos EV, Ioannidis JP. Differential effects of NOD2 variantson Crohn’s disease risk and phenotype in diverse population analysis. Am J Gastroenterol 2004; 99: 2393-2404.
  • 24. Wehkamp J. Reduced Paneth cell alpha-defensins in ileal Crohn’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 18129-18134.
  • 25. Simms LA. Reduced alpha-defensin expression is associated with inflammation and not with NOD2 mutation status in ileal Crohn’s disease. Gut 2008, doi:10.1136/gut2007.142588.
  • 26. Kusek K, Punatik J, Bevins CL, Barnard JA, Kays RJ, Chu H, Macker L, Crandall W. Human alpha defensin 5 mRNA levels are decreased in children with untreated, newly diagnosed Crohn’s disease. Digestive Disease Week 2009, Chicago 30. 5.-4. 6. 2009, A77.

To read this article in full, please register for free on this website.

Benefits for subscribers

Benefits for logged users

Kreditovaný autodidaktický test