Gastroenterologie
a hepatologie

Application of PCR analysis in diagnostics of pacients with liver alveolar echinococcosis

Jana Kinčeková ^Orcid.org  , Gabriela Hrčková ^Orcid.org  , Viera Szabadosová ^Orcid.org  , Jana Hudačková ^Orcid.org  , Mária Stanislayová ^Orcid.org  , Ľubomír Straka ^Orcid.org  , Marián Švajdler Jr. ^{Orcid.org  1}, Peter Bohuš ^Orcid.org  , Marcel Zachar ^Orcid.org  

+ Affiliation
¹ Oddelenie patológie FN L. Pasteura, Košice

Summary

SUMMARY

Kinčeková J, Hrčková G, Szabadošová V, Hudačková J, Stanislayová M, Straka L, Švajdler M ml, Bohuš P, Zachar M. Application of PCR analysis in diagnostics of pacients with liver alveolar echinococcosis

Introduction: The natural life cycle of E. multi-locularis in Europe involves predominantly red foxes as the definitive hosts. The mature segments of parasite containing eggs are dispersed in the environment via the faeces of carnivores. The eggs may contaminate various types of food, including fruits and vegetables collected from gardens or infected meadows and drinking water. Humans become infected by ingestion of contaminated food and water.

Case report: In this study we report two unusual human cases of alveolar echinococcosis (AE) with regard to different clinical manifestation. The first case is a 14-year-old female patient having expansive parasitic foci in the right liver lobe. ELISA assay, western blot and histological examinations of the biopsy after PAS staining confirmed the presence of alveolar echinococcosis. The second case is a 57-year-old woman, operated on primarily for ulcus ventriculis perforatum with no symptoms for parasitic infection. The biopsies of the foci from the right liver lobe were taken incidentally, while performing the revision of the abdomen. In Case 2, AE was confirmed only after molecular characterisation of specific DNA fragment along with histological examinations. Western blot analysis and Em2 + ELISA assay were negative before and after operation.

Conclusion: Today a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assays as well as a highly specific western blot system are commercially available for the serological diagnosis of human alveolar echinococcosis cases. Histological examination of biopsies can increase sensitivity of diagnosis. In addition, molecular biological tools which allow to detect DNA fragments of specific E. multilocularis genes from surgically resected and bioptic materials complete our diagnostic spectrum of methods.

Key words: Alveolar echinococcosis (AE) - case report - ELISA - PCR - serodiagnosis - Western blot.

ÚVOD

Prvé prípady humánnej alveolárnej echinokokózy u µudí na Slovensku boli diagnostikované v roku 2000⁽¹⁾. Výskyt E. Multilocularis u líšok bol na Slovensku prvý krát popísaný v roku 1999, a to hlavne v pohraničných oblastiach na severe. Avšak už v rokoch 2000-2002 sa zistil výskyt pásomnice u líšok na celom území Slovenska s priemernou prevalenciou 30,7 %⁽²⁾. V súčasnosti je najväčším rizikovým faktorom pre šírenie AE na Slovensku extrémne zvýšená populácia líšok hrdzavých, ktorá je dôsledkom vakcinácie voči besnote.

KAZUISTIKA

Pacient 1: 14-ročné dievča

Pochádza z východného Slovenska a žije na dedine, blízko lesa. Vo februári 2006 bola hospitalizovaná na detskom oddelení spádovej nemocnice pre 3 týždne trvajúce bolesti hlavy, únavu, kašeµ a týždeň trvajúce teploty do 40 °C. Pacientka pozorovala vyklenutie brucha v stoji. Palpačným vyšetrením sa zistilo zväčšenie pečene +5 cm. Na základe USG brucha bolo die»a preložené na detskú onkológiu s diagnózou primárneho tumoru pečene.

CT vyšetrenie zobrazilo expanzívne ložisko velkosti 12,5 x 12,3 cm v pravom laloku pečene s početnými kalcifikátmi vo vnútri lezie (obr. 1A, B). Laboratórne vyšetrenie: anémia (Hb 99 g/l), vysoká sedimentácia erytrocytov (142 mm/h), zvýšenie alkalickej fosfatázy (ALP 6,06 μkat/l) a gluta-myltransferázy (GMT 2,56 μkat/l). Eosinofília nebola prítomná.

Bola indikovaná laparotómia. Následne histologické a sérologické vyšetrenie potvrdilo echinokokózu. Po 1. rok trvajúcej terapii (Zentel 600 mg/deň v 2 dávkach) došlo k progresii CT nálezu a zväčšeniu hypodenznej-cystoidnej zložky čo signalizovalo kolikváciu ložiska. V máji 2007 bola operovaná, realizovaná pravostranná hemihepatektómia a rekonštrukcia v. cava inf. z laparotomického prístupu. Výkon bez komplikácií, v stabilizovanom stave pacientka prepustená domov.

Pacient 2: 57-ročná žena

Pacientka bola operovaná pre ulcus ventriculi perforatum bez príznakov parazitárnej infekcie. Per-operačna revízia brušnej dutiny ukázala viacpočetné ložiská v pečeni o velkosti 1-2 cm v oblasti µavého laloka (obr. 2). Excízia ložiska z pečene bola zaslaná na histologické vyšetrenie, kde boli zistené zápalové zmeny s nálezom štruktúr tiel parazitov pozitívne pri PAS-D farbení (obr. 3). Protoskolexy nájdené neboli. Toho času pacientka stabilizovaná, zahájená mebendazolová terapia.

MATERIÁL A METODIKA

Detekcia Echinococcus - špecifických protilátok

Základný test - E. multilocularis - ELISA (Em2+ ELISA)

Detekcia IgG protilátok špecifických voči Echinococcus spp. je založená v praxi na využití celkových natívnych antigénov alebo antigénových frakcií^(3,4). Sérum obidvoch pacientok sme vyšetrovali na prítomnos» špecifických IgG protilátok voči dominatnému parazitickému antigénu Em2+ pomocou nepriameho ELISA testu fi (Bordier Affinity Products, Crissier, Switzerland). V prípade prvej pacientky Em2+ ELISA test potvrdil prítomnos» vysokých titrov (73 %) protilátok. V sére druhej pacientky ELISA testom neboli detekovane žiadne anti-echinokokové protilátky.

Western blot (EmWB) (obr .4)

Následne bola prítomnos» antiparazitických protilátok vyšetrovaná pomocou komerčného Echinococcus Western blot IgG Kit (LDBIO Diagnostics, Lyon, France). Sérum prvej pacientky intenzívne reagovalo s antigénmi s molekulovou (MW) váhou 26-28 kDa , 16 a 18 kDa, ktoré špecificky indikujú prítomnos» infekcie cestódom E. Multilocularis. Na blote sa zistil aj intenzívny 7 kDa band a takéto zloženie pozitívnych antigénových pruhov naznačuje, že môže ís» aj o infekciu parazitom E. Granulosus. V druhom prípade Western blotová analýza, na prítomnos» špecifických echinokokových protilátok bola veµmi slabo pozitívna len s 26-28 kDa špecifickým antigénom.

Polymerázová re»azová reakcia (PCR) pre dôkaz špecifických DNA

Izolácia DNA sa robila v prípade oboch pacientok z excízií, ktoré boli fixované 4% formalínom a zaliate do parafínu podµa štandardnej metódy. Pripravené rezy hrúbky 7 μM boli spracovane PAS farbením (PAS staining Kit, Sigma) na detekciu glycidových molekúl prítomných v lamelárnych membránach parazitických cýst. Nezafarbené rezy po odparafinovaní sa použili na extrakciu DNA. DNA bola izolovaná z tkaniva pomocou fenol/chloroform/izoamyl-alkoholovej metódy⁽⁵⁾. DNA z biopsií pacientok bola použitá ďalej v PCR analýze niekoµkých génov prostreníctvom špecifických oligonukleotidových párov (primerov). V prvej PCR reakcii sme použili pár (JB1-F a JB1-R), ktrorý amplifikuje mitochondriálny gén NADH1 u cestódov s dĺžkou 860 bp⁽⁶⁾, a zistili sme pozitívne reakcie u oboch pacientok. V ďalšej PCR reakcii, DNA bola analyzovaná s primermi EM-H15 and EM-H17, ktoré amplifikujú variabilný úsek mitochondriálneho génu pre malú ribozomálnu podjednotku (12S mt-rDNA) len u druhu E. Multilocularis⁽⁷⁾. V týchto PCR reakciách sa amplifikoval diagnostický úsek génu pre 12S mt-rDNA s dĺžkou 200 bp na DNA z biopsií obidvoch pacientiek, ktorý potvrdil prítomnos» infekcie druhom E. Multilocularis. Každá PCR reakcia bola niekolkokrát zopakovaná a to vždy s pozitívnym výsledkom. Mitochondriálny gén 12S sa používa na diferenciálnu diagnostiku oboch druhov rodu Echinococcus spp. a pre E. Granulosus je diagnostický úsek amplifikovaný primermi Eglf a Eglr a má dĺžku 255 bp⁽⁸⁾. PCR s týmto párom primerov boli negatívne v prípade DNA biopsií u oboch pacientok. Uvedené výsledky jednoznačne diagnostikovali infekciu cestódom E. Multilocularis u oboch prípadov.

DISKUSIA

Od roku 2000 sme diagnostikovali 10 prípadov AE u µudí v rôznej vekovej kategórii. V 7. prípadoch išlo o osoby vyššieho veku, v 2. prípadoch mali pacienti 31 a 41 rokov a v jednom prípade je to die»a vo veku 14 rokov. U všetkých sa jednalo o primárne postihnutie pečene. Séroepidemiologický skrínining je najvhodnejšia forma pre prieskum skutočných epidemiologických parametrov, frekvencie výskytu a geografického rozšírenia tohto parazitárneho ochorenia⁽⁹⁾. Klinické prejavy sa zvyčajne neprejavia v rannej inkubačnej fáze ochorenia, čo niekedy môže trva» aj 10-15 rokov. U väčšiny prípadov sa ochorenie prejaví medzi 50. a 70. rokom života a veµmi zriedkavo u detí⁽⁸⁾. Sailer et al.⁽¹⁰⁾ opísal prípad 6-ročného dievča»a s typickými klinickými symptómami ktoré vyvolala alveolárna echino-kokóza v pečeni pri základnom - AIDS ochorení. Špecifické sérologické testy na prítomnos» parazita tu boli negatívne, ako dôsledok totálnej imunitnej supresie AIDS ochorením. V našom prípade u druhej pacientky sérologické vyšetrenia boli negatívne, a to pravdepodobne v dôsledku začínajúceho štádia alveolárnej echinokokózy Aj napriek výbornej diagnostickej kvalite Em2+ antigénu sa pri niektorých klinicky aj histologický potvrdených AE prípadoch vykazuje negativita, čo sa pripisuje chýbaniu alebo nízkej antigénnej aktivite parazita^(11}. Pacientom, u ktorých sa detekujú stredné a vysoké titre anti-echinokokových protilátok, sa pred ďalšou terapiou doporučuje vyšetrenie rôznymi zobrazovacími technikami. Ultrasonografia a CT sú v týchto prípadoch veµmi vhodné na presnú identifikáciu velkosti lézií a ich lokalizáciu v pečeni⁽¹²⁾.

ZÁVER

V súčasnosti sa v sérologickej diagnostike alveolárnej echinokokózy u µudí využívajú veµmi citlivé komerčne dostupné testy ELISA a Western blot. Histologické vyšetrenie biopsií umožňuje charakterizova» lezie morfologicky a zvyšuje citlivos» diagnostiky. Z našich výsledkov a ďalších štúdií vyplýva, že i veµmi citlivé diagnostické metódy môžu ma» v niektorých prípadoch obmedzenú využiteµnos». Ide o skoré štádia parazitárneho ochorenia, prípadne u imunologický deficientnych pacientov.

V takýchto prípadoch, ak je k dispozícií biopsia z lezie nejasnej etiológie, je molekulárna metóda jediným a nanajvýš presným diagnostickým prostriedkom. V prípade infekcie rodom Echinococcus spp. sa javí by» najvhodnejším diagnostickým génom malá ribozomálna podjednotka mitochondrií (12S). Výskyt mnohých kópií DNA v bunkách umožňuje rozlíši» druh E. multilocularis od druhu E. granulosus, čo sa sérologicky dá urči» presne len málokedy.

Práca vznikla s finančnou podporou Grantovej agentúry pre vedu SR pri riešení projektov APVV č. 51-027605 a VEGA č. 2/7186/27.

LITERATÚRA

• 1. Kinčeková J, Auer H, Reiterová K, Dubinský P, Szilágyiová M, Lauko L, Aspôck H. The first case of autochtonous human alveolar echinococcosis in the Slovak republic. Mitt Osterr Ges Tropenmed Parasitol 2001; 23: 33-38.
• 2. Miterpákova M, Dubinský P, Reiterová K, Machkova A, Várady M, Snábel V. Spatial and temporal analysis of the Echinococcus multilocularis occurence in the Slovak Republic. Helminthologia 2003; 40: 217-226.
• 3. Zhang W, Li J, McManus D P. Concepts in immunology and diagnosis of hydatid disease. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 18-36.
• 4. Candolft E, Kien T, Chaker E, Fourati M, Beyonnes A. Intérét de l'antigenemie et des anticorps IgG.IgM, IgA, IgE dans µimmunosérologiedu kyste hydatique. Résultats de la technique imuno-enzymatique á propos de 87 cas. Bull Soc Pathol Exot 1986; 78: 700-706.
• 5. Cao W, Hashibe MPH, Rao JYR, Morgenstern H, et al. Comparison of methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues and buccal cells. Cancer Detection and Prevention 2003; 27: 397-404.
• 6. Stieger C, Ileggin D, Schwarzenbach G, Mathis A, Deplazes P: Spatial and temporal aspects of urban transmission of Echinococcus multilocularis. Parasitology2002; 124: 631-640.
• 7. Dinkel A, von Nickisch-Rosenegk M, Bilger B, et al. Detection of Echinococcus multilocularis in the definitive host; coprodiagnosis by PCR as an alternative to necropsy. J Clin Microbiol 1998; 36: 1871-1876.
• 8. Štefánie S, Shaikenov B S, Deplazes P, et al. Polymerase chain reaction for detection of patent infections of Echinococcus granulosus ("sheep strain") in naturally infected dogs. Parasitol Res 2004; 92: 347-351.
• 9. Auer H. Die Bedeutunglaboratoriumsdiagnostischer Untersuchung fur die Klinik, die Epidemiológie und Prevention der alveolären Echinokokkose - Erfahrungen zweier Jahrzente in Ôsterreich. Wien Klein Wochenschr 2006; 118 (3): 18-26.
• 10. Sailer M, Soelder B, Allerberger F, Zaknun D, et al. Alveolar echinococcosis of the liver in a six-year-old girl with acquired Immunodeficiency syndrome. The Journal of Pediatrics 1997; 130: 320-323.
• 11. Gottstein B, Jacquier P, Bresson-Hadni S, Eckert J: Improved primary immunodiagnosis of alveolar echinococcosis in humans by an enzyme-linked immunosorbent assay using the Em2+ antigen. Journal of Clinical Microbiology 1993; 31: 373-376.
• 12. Reuter S, Nussle K, Kolokythas O, Hang U, Rieber A, Kern P, Kratzer W: Alveolar liver echinococcosis: A comparative study of three imaging techniques. Infection 2001; 29: 119-125.

To read this article in full, please register for free on this website.

Benefits for subscribers

Benefits for logged users