Gastroenterologie
a hepatologie

Změny genové exprese asociované s DALM u ulcerózní kolitidy

Jiří Švec¹, Jana Musílková ^Orcid.org  , Jana Bryndová ^Orcid.org  , Tomáš Jirásek ^Orcid.org  , Václav Mandys², Milan Kment¹, Jiří Pácha ^Orcid.org  

+ Pracoviště
¹ II. interní klinika 3. LF UK a FNKV Praha
² Ústav patologie, 3. LF UK a FNKV, Praha

Souhrn

Úvod: Dlouhotrvající ulcerózní kolitida (UC) je spojena se zvýšeným rizikem vzniku kolorektálního karcinomu (CRC). Nárůst exprese některých proproliferativních a antiapoptotických genů, jako jsou survivin, katalytická podjednotka telomerázy (hTERT), integrinová kináza (ILK) a transkripční faktory c-MYB a Tcf-4, byl nalezen během vzniku a vývoje mnoha lidských malignit včetně kolorek-tálního karcinomu.

Cíl studie: Ve studii jsme stanovili expresi výše zmíněných markerů a prozánětlivých enzymů cyklooxygenázy 2 (COX-2) a inducibilní NO syntázy (iNOS) v bioptických vzorcích ulcerózní kolitidy s neoplastickými změnami epitelu a ve vzorcích pacientů operovaných pro kolorektální karcinom.

Materiál a metodika: Hladiny transkriptů byly měřeny pomocí kvantitativní PCR v 19 vzorcích od pacientů s chronickou ulcerózní kolitidou a 12 vzorcích pacientů operovaných pro kolorektální karcinom.

Výsledky: Tkáňové vzorky získané od nemocných s neoplastickými změnami vykazovaly signifikantně zvýšené transkripty pro survivin, c-MYB, Tcf-4, COX-2 a iNOS, zatímco exprese hTERT a ILK nebyla zvýšena. Naopak ve vzorcích karcinomu tlustého střeva byla zvýšena exprese nejen survivinu, c-MYB, Tcf-4, COX-2, iNOS, ale také hTERT.

Závěr: Získané výsledky naznačují, že transkripční aktivace hTERT a ILK se pravděpodobně objevuje v pozdějších stadiích vývoje kolorektálního karcinomu, zatímco zvýšení exprese survivinu, c-MYB a Tcf-4 je spojeno se vznikem neoplazie a zdá se, že by jejich stanovení mohlo sloužit jako časný marker kolorektální kancerogeneze asociované s ulcerózní kolitidou.

Klíčová slova: ulcerózní kolitida - neoplazie - kolorektální karcinom.

ÚVOD

Mnohé poznatky ukazují na kauzální souvislost mezi chronickým zánětem a vznikem některých epiteliálních nádorů. Pacienti s idiopatickými střevními záněty, zejména dlouhotrvající ulcerózní kolitidou mají zvýšené riziko vzniku kolorektálního karcinomu, který představuje jednu z nejzávažnějších komplikací UC(1). Riziko vzniku CRC vzrůstá v závislosti na intenzitě zánětu, rozsahu postižení a délce trváni choroby. Karcinom při ulcerózní kolitidě vzniká především z dysplastických lézí typu DALM (dysplasia-associated lesion or mass), a tím se makroskopicky odlišuje od sporadického karcinomu, který má původ převážně z adenomových polypů.

Přesný mechanismus, jakým chronický slizniční zánět podmiňuje vznik karcinomu u UC, není plně objasněn. Zánět je mimo jiné spojen s aktivací signalizační dráhy NF-KB, která vede ke zvýšené expresi regulačních genů, jako jsou inducibilní NO syntáza a cyklooxygenáza 2, které vykazují anti-apoptotický efekt ⁽²³⁾ . Zvýšená produkce NO a pro-staglandinů v místě zánětu přispívá ke tkáňovému poškození s následnou aktivací reparativních procesů, které zvyšují riziko tumorigeneze. NO navíc inhibuje kaspázy a může způsobit poškození DNA i inhibici DNA opravných mechanismů ⁽⁴⁾ . Podobně prostaglandiny modulují regulační mechanismy řídící buněčný růst, diferenciaci a angiogenezi⁽²⁾. Zvýšená exprese iNOS a COX-2 byla nalezena jak u adenomů, tak karcinomů tlustého střeva ^(5-7) .

Nicméně vývoj změn sekvence normální epitel - reaktivně chronicky zanícený epitel - dysplazie - karcinom vyžaduje závažné narušení regulačních mechanismů proliferace, diferenciace a apoptózy což je podmíněno alterací nejen COX-2 a iNOS, ale celé řady dalších genů. Současné pokroky v molekulární onkológii identifikovaly změny v mnoha genech, jako jsou K-ras, c-MYC, regulační a cílové geny Wnt/ β-katenin signální dráhy, členové rodiny IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein family), matrixmetaloproteinázy, telomeráza a mnohé další. Zejména exprese transkripčního faktoru c-MYB je zřetelně zvýšena u kolorektálního karcinomu ⁽⁸⁾ a naopak snížení jeho exprese je spojeno s diferenciací kolonocytů a jejich apoptózou ⁽⁹⁾ . Podobně survivin, člen IAP rodiny, je zvýšeně exprimován ve tkáni CRC ^(10,11) a exprese integrinové kinázy (ILK), významného mediátora integrinové signalizace, pozitivně koreluje s progresí kolorektálního karcinomu ^(12,13) .

Některé práce také ukazují na roli β-kateninu a Tcf-4, faktorů zúčastněných ve Wnt signální dráze, jejichž exprese je zvýšena u CRC ⁽¹⁴⁾ . Obdobně telomerázová aktivita i hladina hTERT mRNA je vyšší ve tkáni kolorektálního karcinomu ^(15,16) .

Ačkoli byly studovány mnohé proproliferativní a antiapoptotické geny jako potenciální molekulární markery sloužící k přesnějšímu odhadu neoplastického potenciálu dané leze, jejich expresní profil během progrese chronicky zanícené sliznice v karcinom není dosud dostatečně poznán.

Cílem této práce bylo ozřejmit expresi mRNA vybraných prozánětlivých (iNOS, COX-2), propro-liferativních a antiapoptotických markerů (c-MYB, ILK, survivin, Tcf-4, hTERT) u pacientů s dlouhotrvající ulcerózní kolitidou se zachycenými neoplastickými změnami a porovnat ji se vzorky sporadického kolorektálního karcinomu.

MATERIÁL A METODA

Pacienti a tkáňové vzorky

Endoskopické vzorky byly získány během kolonoskopického vyšetření pacientů s chronickou ulcerózní kolitidou v trvající dlouhodobé klinické a endoskopické remisi. Žádný z pacientů nebyl léčen vysokými dávkami imunosupresiv či biologickou terapií. Složení souboru spolu s trváním UC je uvedeno v tabulce 1. Dva pacienti měli pankolitidu, čtyři levostrannou kolitidu.

U dvou pacientů byly nalezeny slizniční leze typu DALM, pro které byl v prvním případě proveden resekční výkon, ve druhém endoskopická mukózní resekce. Biopsie byly sbírány do 1 ml RNAlateru (Ambion) a uchovávány při -80 °C. Paralelní biopsie byly odebrány k histologickému vyšetření. Tkáňové vzorky sporadického kolorektálního karcinomu byly odebrány z centrální části tumoru a kontrolní tkáň z makroskopicky zdravého okraje resekátu. Ihned po odebrání byly zmraženy a uchovány v tekutém dusíku. Žádný z operovaných pacientů nebyl léčen neoadjuvantní rádioterapií či chemoterapií. Studie byla schválena etickou komisí 3. LF UK v Praze a od všech pacientů byl získán informovaný souhlas.

Histologie

Histologický byly podrobně vyšetřeny endoskopické vzorky pěti pacientů, v šestém případě se jednalo o resekční preparát céka a kolon ascendens s terminálním ileem. Vzorky byly zpracovány standardní histologickou technikou; po fixaci 10% formolem byly zality do parafínu a krájeny na tkáňové řezy, následně barvené hematoxylinem a eozinem. Všechny preparáty byly hodnoceny dvěma patology (VM a TJ). U všech šesti pacientů byl mikroskopický obraz v souladu s klinickou dignózou chronické ulcerózní kolitidy v remisi. Podle Vídeňské klasifikace gastrointestinálních epiteliálních neoplazií ⁽¹⁷⁾ byly čtyři pacienti hodnoceni jako kategorie 1 (bez dysplastických změn); u dvou nemocných byly navíc zastiženy změny spadající do kategorie 5 (v jednom případě intramukózní karcinom, ve druhém invazivní karcinom v resekčním preparátu). Typické histologické nálezy jsou prezentovány na obrázcích 1 až 3.

U všech dvanácti vzorků sporadického kolorektálního karcinomu zahrnutých v této studii (tab. 1) byla diagnóza histologický ověřena, nádory byly hodnoceny jako kolorektální adenokarcinomy V jednom případě byl zachycen simultánní B-non-Hodgkinův lymfom v retroperitoneální uzlině, přičemž buňky tohoto lymfomu nebyly nalezeny ve vyšetřovaném vzorku střevní tkáně.

RNA izolace a syntéza cDNA

Endoskopické biopsie byly homogenizovaný v 500 μl lyzačního pufru pomocí přístroje MagNA Lyser (Roche) a celková RNA izolována extrakčním kitem GenElute Mammalian Total RNA kit (Sigma-Aldrich) podle doporučení výrobce. Integrita a koncentrace izolované RNA byly posouzeny mikrokapilární elektroforézou pomocí Agilent 2100 Bioanalyzátoru a RNA 6000 Nano LabChip kitu (Agilent Technologies). Průměrná hodnota RIN (RNA integrity number) z biopsií pacientů s UC byla 8,1 ± 0,1 (SEM) a kontrolních biopsií 8,2 ± 0,2. Biopsie s hodnotou RIN < 6 nebyly do další analýzy zařazeny.

cDNA byla syntetizována ve 20 μl reakci pomocí random primerů, lOmM dNTPmix, 40 U RNase-OUT a 200 U M-MLV reverzní transkriptázy (Invitrogen) během 1 hodinové inkubace při 37 °C podle protokolu výrobce a uschována při -20 °C.

Relativní kvantifikace genové exprese

PCR reakce, vždy v duplikátu, byly provedeny pomocí přístroje ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) s použitím TaqMan Gene Expression Master Mixu a předsyntetizovaných prób značených barvou FAM a dvojice primerů TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) pro geny COX-2 (kat. č. Hs00153133_m1), iNOS (kat. č. Hs 00167248_m1), hTERT (kat. č. Hs 00162669_m1), ILK (kat. č. Hs 00177914_m1), c-MYB (kat. č. Hs 00193527_m1), Tcf-4 (kat. č. Hs 00162613_m1), survivin (kat. č.Hs 00153353_m1) a pro referenční geny (β2-microglobulin, B2M (kat. č. Hs 99999907_ml), TATA box-binding protein, TBP (kat. č. Hs 00427620_m1) ahypoxantin fosforibosyltransferázu, HPRT1 (kat. č. Hs 99999909_m1) ve 20 μl reakci. Reakční podmínky byly následující: inkubace s Uracil-DNA glykosylázou 2 minuty při 50 °C, aktivace DNA polymerázy 10 minut při 95 °C, následovaná 45 cykly denaturace 15 sekund při 95 °C a nasednutí/extenze 1 minutu při 60 °C. Referenční geny byly vybrány z různých funkčních skupin s ohledem na jejich užití v podobných studiích. Exprese daného genu byla normalizována vůči TBP, jehož exprese vykazovala největší stabilitu za daných podmínek, určené dle Chen, Silver ^(18,19) . Abychom potvrdili tyto výsledky, porovnali jsme měření simplexové a duplexové PCR, ve které jsou amplifikovány specifické sekvence jak zkoumaného, tak referenčního genu v jedné reakci. V tomto případě byly TaqMan próby přidány v poměru 0,6 μl pro daný gen (FAM/MGB) a 1,4 μl pro TBP (VIC/MGB; kat. č. 4326322E) v celkovém reakčním objemu 30 μl. Za stejných reakčních podmínek nebyly zaznamenány signifikantní rozdíly mezi simplexovými a duplexními měřeními. Relativní genová exprese byla vypočtena metodou 2-&Delta^;Ct, kde -ΔCt představuje rozdíl průměrných Ct hodnot daného genu a TBP.

Statistická analýza

Data jsou prezentována jako medián, 25. a 75. per-centil a min. - max. rozpětí. Neparametrická statistická analýza byla provedena pomocí programu Statistica 6.1 (StatSoft Inc.). Bioptické vzorky pacientů kategorie VI a V5 a vzorky kolorektálního karcinomu s normální sliznici byly porovnány pomocí neparametrického Mann-Whitney U-testu. Hodnota p < 0,05 byla brána jako statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

Bioptické vzorky zahrnuté do této studie byly rozděleny do dvou skupin podle použité histologické klasifikace - kategorie VI a V5. Díky účinné extrakční metodě RNA a vysoce citlivé qPCR jsme byli schopni detekovat všechny transkripty v celém souboru biopsií. Po jejich vzájemném porovnání tkáňové vzorky s neoplastickými změnami vykazovaly signifikantní nárůst exprese všech stanovaných transkriptů kromě hTERT a ILK. Medián exprese COX-2 byl 6,9x a iNOS 2x vyšší u skupiny V5 oproti VI. Skupina V5 dále vykazovala zvýšenou expresi mRNA pro survivin 14,2x, c-MYB 2,8x aTcf-4 52,8x (obr. 4).

K další analýze hladin survivinu, ILK, hTERT, Tcf-4, c-MYB a potvrzení role v kolorektální karcinogenezi jsme stanovili jejich expresi také ve vzorcích sporadického kolorektálního karcinomu. Tabulka 2 ukazuje zvýšenou expresi survivinu, c-MYB, hTERT a Tcf-4 v nádorové tkáni oproti okolní normální sliznici. Medián exprese hTERT byl zvýšen 6,2x, c-MYB 5,2x, survivin 4,8x a Tcf-4 l,9x. Naopak exprese ILK mRNA nebyla v tomto souboru zvýšena. Porovnání exprese iNOS a zejména COX-2 mRNA ukázalo, že oba enzymy jsou vysoce aktivovány ve vzorcích kolorektálního karcinomu (medián COX-2: 15,3x; iNOS: 3,8x).

DISKUSE

Kolorektální karcinom je jednou z nejzávažnějších komplikací pacientů s ulcerózní kolitidou a chronický zánět představuje klíčový predisponující faktor jeho vzniku. Detekce choroby v časných stadiích progrese reaktivně změněného epitelu směrem ke kolorektálnímu karcinomu je obtížná, stejně jako histologická diagnóza počínajících dysplastických změn. Proto jsou hledány nové diagnostické možnosti využívající zejména metod molekulární biologie a genetiky. Mnohé geny a jejich proteinové produkty upoutaly pozornost jako nadějné markery časných neoplastických změn, nicméně jsou studovány převážně v procesu kancerogeneze u sporadických karcinomů a mnohem méně u nádorové transformace spojené s ulcerózní kolitidou.

V této studii jsme analyzovali mRNA významných proproliferativních a antiapoptotických genů, které jsou spojovány s časnými stadii tumorigeneze a porovnali jejich hladiny exprese mezi sporadickým CRC a ulcerózní kolitidou s morfologicky zachycenými neoplastickými změnami. Ačkoli přesný mechanismus s UC-asociované tumorigeneze není zcela objasněn, jedním z významných mechanismů se zdá být produkce NO a následných reaktivních metabolitů ⁽²⁰⁾ . Naše výsledky ukazují, že exprese iNOS je signifikantně zvýšena nejen ve vzorcích UC pacientů s neoplazií, ale také ve tkáni kolorektálního karcinomu a jsou ve shodě s předchozími nálezy zvýšené exprese a aktivity iNOS u pacientů s IBD a nádory tlustého střeva ^(5,21) .

Podobně jako iNOS i COX-2 , klíčový enzym v konverzi kyseliny arachidonové na prostaglandiny, vykazovala zvýšenou expresi. COX-2 podporuje buněčnou proliferaci, angiogenezu a inhibuje indukci apoptózy ^(2,22) . Naše práce ukazuje, že zvýšená exprese COX-2 u pacientů s neoplazií je výrazně vyšší oproti pacientům s UC bez dysplazie a podporuje význam tumor-promočního působení pro-staglandinových derivátů ⁽²⁾ . Jedna dráha, která aktivuje cílové geny, jako je COX-2 či c-MYC, vyžaduje transkripční faktor c-MYB, jehož zvýšená exprese byla nalezena v humánních tumorech⁽²³⁾ . Naše výsledky ukazují, že c-MYB a COX-2 jsou zvýšeně exprimovány nejen v pokročilém CRC, ale i v časné neoplazii u ulcerózní kolitidy.

Konstitutivní aktivace Wnt/β-katenin signální dráhy je častým nálezem u kolorektálního karcinomu, kde stabilizace β-kateninu a jeho navázání s Tcf transkripčními faktory vede k expresi mnoha genů významných pro onkogenezi ⁽²⁴⁾ . Ve shodě s tímto modelem kolorektální karcinogeneze jsme nalezli aktivaci Wnt dráhy na úrovni Tcf-4 mRNA nejen u sporadického CRC, ale také v neoplastické tkáni u ulcerózní kolitidy.

V souladu s faktem, že survivin je cílový gen Wnt / β-katenin signální dráhy a Tcf-4 je jedním z hlavních transkripčních faktorů regulujících jeho promotorovou aktivitu⁽²⁵⁾ , jsme pozorovali podstatné zvýšení exprese mRNA pro survivin nejen ve sporadickém CRC, ale také v neoplastické tkáni u UC. Zdá se tedy, že zvýšení exprese survivinu, klíčového regulátoru buněčného dělení a současně inhibitoru apoptózy může podporovat vznik neoplazie a karcinomu v chronicky zanícené střevní sliznici.

Dalším proteinem, jehož aktivace podmiňuje trvalou schopnost buněčné proliferace, je telomeráza. Většina studií nalezla zvýšenou telomerázovou aktivitu i expresi hTERT mRNA v kolorektálních karcinomech ^(15,26-28) . Naopak rozdílné výsledky byly získány u pacientů s ulcerózní kolitidou ^(29-31) . V naší práci byla hladina hTERT mRNA výrazně zvýšena u vzorků CRC, ale ne ve vzorcích UC pacientů s neoplazii. Výsledky kvantitativní PCR spolu s předchozím měřením telomerázové aktivity ^(29,30) naznačují, že ke zvýšení exprese hTERT mRNA nedochází během časných stadií sekvence chronický zánět - dysplazie - karcinom, ale je pravděpodobně spojena s pozdějším vývojem kolorektálního karcinomu, jak navrhl Kanamaru ⁽³²⁾ .

Obdobně lze usuzovat, že k podstatnému navýšení exprese integrinové kinázy ILK dochází až v pozdních stadiích kolorektální karcinogeneze, zejména v buněčné subpopulaci s vysokou invazivitou a schopností metastázova ⁽³³⁾ , kterou jsme při analýze povrchových biopsií nezachytili. Tuto úvahu podporuje i 3,8x zvýšená exprese ILK (p < 0,005) v xenograftových tumorech linie SW 620, izolované z metastázy CRC, hodnocených oproti kontrolní střevní sliznici (dosud nepublikovaná data).

ZÁVĚR

Použili jsme kvantitativní RT-PCR přístup ke studiu genové exprese panelu významných proproliferativních a antiapoptotických genů spojených s tumorigenezí u pacientů s neoplazii asociovanou s ulcerózní kolitidou, klinicky hodnocenou jako DALM a porovnali jsme tyto změny se sporadickým kolorektálním karcinomem. Ukázali jsme poprvé kvantitativní vztah těchto genů mezi neoplastickou a nedysplastickou sliznici pacientů s chronickým zánětem a nalezli zvýšenou expresi mRNA pro survivin, c-MYB, Tcf-4, COX-2, iNOS u pacientů s chronickou ulcerózní kolitidou a neoplastickými změnami.

Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva zdravotnictví CRIGA 1A/8651-4.

Autoři děkují kolektivu lékařů Chirurgické kliniky 3. LF UK a FNKV Praha za umožnění sběru vzorků kolorektálního karcinomu.

LITERATURA

• 1. Itzkowitz SH, Yio X. Inflammation and cancer IV Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role of inflammation. Am J Physiol 2004; 287: G7-G17.
• 2. Williams CS, Mann M, DuBois RN. The role of cyclooxygenases in inflammation, cancer, and development. Oncogene 1999; 18: 7908-7916.
• 3. Kim PK, Zámora R, Petrosko P, Billiar TR. The regulatory role of nitric oxide in apoptosis. Int Immunopharmacol2001; 1: 1421-1441.
• 4. van der Woude CJ, Kleibeuker JH, Jansen PL, Moshage H. Chronic inflammation, apoptosis and (pre-) malignant lesions in the gastro-intestinal tract. Apoptosis 2004; 9: 123-130.
• 5. Ambs S, Merriam WG, Bennett WP, Felley-Bosco E, Ogunfusika MO, Oser SM, Klein S, Shields PG, Billiar TR, Harris CC. Frequent nitric oxide synthase-2 expression in human colon adenomas: implication for tumor angiogenesis and colon cancer progression. Cancer Res 1998; 58: 334-341.
• 6. Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, Giardiello FM, Ferrenbach S, DuBois RN. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology 1994; 107: 1183-1188.
• 7. Sáno H, Kawahito Y, Wilder RL, Hashiramoto A, Mukai S, Asai K, Kimura S, Kato H, Kondo M, Hla T. Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in human colorectal cancer. Cancer Res 1995; 55: 3785-3789.
• 8. Ramsay RG, Thompson MA, Hayman JA, Reid G, Gonda TJ, Whitehead RH. Myb expression is higher in malignant human colonic carcinoma and premalignant adenomatous polyps than in normal mucosa. Cell Growth Differ 1992; 3: 723-730.
• 9. Thompson MA, Rosenthal MA, Ellis SL, Friend AJ, Zorbas MI, Whitehead RH, Ramsay RG. c-Myb down-regulation is associated with human colon cell differentiation, apoptosis, and decreased Bcl-2 expression. Cancer Res 1998; 58: 5168-5175.
• 10. Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, Toyoda M, Tenjo T, Tanigawa N. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer. Cancer Res 1998; 58: 5071-5074.
• 11. Endo T, Abe S, Seidlar HB, Nagaoka S, Takemura T, Utsuyama M, Kitagawa M, Hirokawa K. Expression of IAP family proteins in colon cancers from patients with different age groups. Cancer Immunol Immunother 2004; 53: 770-776.
• 12. Marotta A, Parhar K, Owen D, Dedhar S, Salh B. Characterisation of integrin-linked kinase signalling in sporadic human colon cancer. Br J Cancer. 2003; 88: 1755-1762.
• 13. Bravou V, Klironomos G, Papadaki E, Taraviras S, Varakis J. ILK over-expression in human colon cancer progression correlates with activation of p-catenin, down-regulation of E-cadherin and activation of the Akt-FKHR pathway. J Pathol 2006; 208: 91-99.
• 14. Barker N, Huls G, Korinek V, Clevers H. Restricted high level expression of Tcf-4 protein in intestinal and mammary gland epithelium. Am J Pathol 1999; 154: 29-35.
• 15. Engelhardt M, Drullinsky P, Guillem J, Moore MA. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer. Clin Cancer Res 1997; 3: 1931-1941.
• 16. Yoshida K, Sugino T, Goodison S, Warren BF, Nolan D, Wadsworth S, Mortensen NJ, Toge T, Tahara E, Tarin D. Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. Br J Cancer 1997; 75: 548-553.
• 17. Schlemper RJ, Riddell RH, Kato Y, Borchard F, Cooper HS, Dawsey SM, Dixon MF, Fenoglio-Preiser CM, Fléjou JF, Geboes K, Hattori T, Hirota T, Itabashi M, Iwafuchi M, Iwashita A, Kim YI, Kirchner T, Klimpfinger M, Koike M, Lauwers GY, Lewin KJ, Oberhuber G, Offner F, Price AB, Rubio CA, Shimizu M, Shimoda T, Sipponen P, Solcia E, Stolte M, Watanabe H, Yamabe H. The Vienna classification of gastrointestinal epithelial neoplasia. Gut 2000;47:251-255.
• 18. Chen Y, Zheng B, Robbins DH, Lewin DN, Mikhitarian K, Graham A, Rumpp L, Glenn T, Gillanders WE, Cole DJ, Lu X, Hoffman BJ, Mitas M. Accurate discrimination of pancreatic ductal adenocarcinoma and chronic pancreatitis using multi-marker expression data and samples obtained by minimally invasive fine needle aspiration. Int J Cancer 2007; 120: 1511-1517.
• 19. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol 2006; 7: 33.
• 20. Jaiswal M, LaRusso NF, Gores GJ. Nitric oxide in gastrointestinal epithelial cell carcinogenesis: linking inflammation to oncogenesis. Am J Physiol 2001; 281: G626-G634.
• 21. Singer II, Kawka DW, Scott S, Weidner JR, Mumford RA, Riehl TE, Stenson WF. Expression of inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine in colonic epithelium in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1996; 111: 871-885.
• 22. Sheng H, Shao J, Morrow JD, Beauchamp RD, DuBois RN. Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells. Cancer Res 1998; 58: 362-366.
• 23. Ramsay RG, Barton AL, Gonda TJ. Targeting c-Myb expression in human disease. Expert Opin Ther Targets 2003; 7: 235-348.
• 24. Gavert N, Ben-Ze'ev A. p-Catenin signaling in biological control and cancer. J Cell Biochem 2007; 102: 820-828.
• 25. Zhang T, Otevřel T, Gao Z, Gao Z, Ehrlich SM, Fields JZ, Boman BM. Evidence that APC regulates survivin expression: a possible mechanism contributing to the stem cell origin of colon cancer. Cancer Res 2001; 61: 8664-8667.
• 26. Yoshida R, Kiyozuka Y, Ichiyoshi H, Senzaki H, Takada H, Hioki K, Tsubura A. Change in telomerase activity during human colorectal carcinogenesis. Anticancer Res 1999; 19: 2167-2172.
• 27. Ghori A, Usselmann B, Ferryman S, Morris A, Fraser I. Telomerase expression of malignant epithelial cells correlates with Dukes' stage in colorectal cancer. Colorectal Dis 2002; 4: 441-446.
• 28. Nowak J, Januszkiewicz D, Lewandowski K, Nowicka-Kujawska K, Pernak M, Rembowska J, Nowak T, Wysocki J. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003; 15: 75-80.
• 29. Usselmann B, Newbold M, Morris AG, Nwokolo CU. Deficiency of colonic telomerase in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 2001; 96: 1106-1112.
• 30. Kleideiter E, Friedrich U, Möhring A, Walker S, Höring E, Maier K, Fritz P, Thon KP, Klotz U. Telomerase activity in chronic inflammatory bowel disease. Dig Dis Sci 2003; 48: 2328-2332.
• 31. Myung SJ, Yang SK, Chang HS, Byeon JS, Kim KJ, Hong SS, Jeong JY, Lee SM, Hong WS, Kim JH, Min YI. Clinical usefulness of telomerase for the detection of colon cancer in ulcerative colitis patients. J Gastroenterol Hepatol 2005; 20: 1578-1583.
• 32. Kanamaru T, Tanaka K, Kotani J, Ueno K, Yamamoto M, Idei Y, Hisatomi H, Takeyama Y. Telomerase activity and hTERT mRNA in development and progression of adenoma to colorectal cancer. Int J Mol Med 2002; 10: 205-210.
• 33. Troussard AA, Costello P, Yoganathan TN, Kumagai S, Roskelley CD, Dedhar S. The integrin linked kinase (ILK) induces an invasive phenotype via AP-1 transcription factor-dependent upregulation of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9). Oncogene 2000; 19: 5444-5452.

Pro přístup k článku se, prosím, registrujte.

Výhody pro předplatitele

Výhody pro přihlášené